Борис Бабочкин родился 5 (18) января 1904 года в Саратове, в семье железнодорожника. Окончил сельскую школу.

Участник Гражданской войны. В пятнадцать лет комсомолец Борис Бабочкин служил в политотделе 4-й армии Восточного фронта.

В 1921 году окончил Театральную студию И. Н. Певцова. Летом 1921 в числе «молодых мастеров» во главе с Певцовым Бабочкин провел свой первый профессиональный сезон в театре Иваново-Вознесенска.

Также работал в театрах Могилёва, Костромы, Бердичева, Воронежа, Самарканда, Пишпека, в Московском театре имени МГСПС и Московском драматическом театре (за пять лет — более двухсот ролей).

С 1927 года — актёр ленинградского Театра сатиры. В 1931—1935 годах — актёр Ленинградского академического театра драмы им. Пушкина.

С 1935 года Борис Бабочкин был актёром, режиссёром, а с 1938 года — художественным руководителем Большого драматического театра им. Горького.

В 1940 году Бабочкин покинул БДТ, работал в Москве в Театре имени Е. Вахтангова, с 1947 года был актёром и режиссёром Театре-студии киноактёра, в 1949—1951 годах — актёром и режиссёром Малого театра.

С 1951 года Борис Бабочкин работал в Народном театре Софии (Болгария), где поставил спектакли: «Разлом» Лавренёва, «Дачники» М. Горького, «Лейпциг, 33» Компанейца и Кронфельда. По возвращении в СССР, в 1952—1953 годах, был главным режиссёром Московского театра им. Пушкина. В 1955 году вернулся в Малый театр.

С 1927 года снимался в кино.

Актёрские работы в театре: Чацкий («Горе от ума» А. С. Грибоедова), Самозванец («Борис Годунов», А. С. Пушкина), Огнев («Фронт» А. Е. Корнейчука), Клаверов («Тени» М. Е. Салтыкова-Щедрина) и другие.

Крупнейшая режиссёрская работа — постановки пьесы М. Горького «Дачники», осуществлённые в 1939 в Большом драматическом театре (играл роль Власа), в 1964 в Малом театре (играл роль Суслова), в 1967 спектакль был экранизирован. Поставил также в Малом театре спектакли «Иванов» Чехова (1960, играл главную роль), «Правда хорошо, а счастье лучше» Островского (1966, играл роль Грознова) и др.

Мировую известность принесло актёру создание образа Чапаева в одноимённом фильме (1934). Слияние эпического размаха и глубоко понятой индивидуальности в характере народного героя, рождённого революцией, было вкладом Бабочкина в галерею типичных образов революции. Творчество Бабочкина отличало разнообразие красок, ему были близки публицистическая драма (роль Аадама в «Браконьерах» Раннета), трагедия, спектакли тонких, лирических настроений.

С 1944 года преподавал во ВГИКе (с 1966 — профессор).

Скончался Борис Бабочкин 17 июля 1975 года в Москве, похоронен на Новодевичьем кладбище (участок № 2).