Франсуа Трюффо родился 6 февраля 1932 года в Париже. Будучи внебрачным ребёнком секретарши газеты «Лилюструасьон» Жанин де Монферран, он не знал своего настоящего отца — сразу после рождения Жанин отдала мальчика кормилице. 9 ноября 1933 года Жанин вышла замуж за чертёжника из архитекторской фирмы Ролана Трюффо (весной 1934 года у них родился сын Рене, но Франсуа сводного брата так и не увидел, потому что ребёнок умер через два месяца после рождения), который усыновил Франсуа и дал ему свою фамилию. Однако, несмотря на это, с самого рождения Трюффо жил на попечении различных нянь и своей бабушки, Женевьевы де Монферран, жившей в IX округе Парижа, которая привила ему свою любовь к книгам и музыке. С бабушкой он прожил вплоть до её смерти, когда ему было 10 лет, после чего впервые воссоединился с матерью и отчимом. Однако, в их квартире для него не было комнаты, и он спал в коридоре. Случайно найдя дневник Ролана Трюффо Франсуа узнал, что тот ему не родной отец. В 1962 году родители развелись, а в 1968 Франсуа обратился в детективное агентство в попытке отыскать своего биологического отца. Расследование в конечном итоге показало, что его отцом мог быть дантист-еврей португальского происхождения и уроженец Байонна Ролан Леви, который учился в Париже в меж-военный период и переехал в Труа с приходом нацистских войск. Детективы установили, что Леви в июле 1949 года женился на Андре Блюм и у них родилось двое детей, но в 1959 году они развелись. Хотя его родня со стороны Жанин отрицала, что его отцом был Леви, сам Франсуа всё же поверил в эту версию.

Живя с матерью и отчимом, Трюффо старался проводить как можно больше свободного времени с друзьями, лишь бы быть вне дома. Его лучшим другом с юности и до смерти был Робер Ляшене, который стал прототипом друга Антуана Дуанеля Рене Беже в фильме Трюффо «Четыреста ударов», а также ассистентом в некоторых других его фильмах. В восемь лет Франсуа увидел первый в своей жизни фильм «Paradis Perdu» Абеля Ганса. Это стало началом его киномании, которая привела к тому, что Трюффо начал прогуливать школу и пробираться в кинозалы «зайцем», если у него не хватало денег на билет. Будучи из-за этого исключённым из нескольких школ, будущий режиссёр в 14 лет решил начать самостоятельную жизнь и окончательно бросил школу. Одна из его юношеских «академических целей» состояла в том, чтобы «просмотреть в день три фильма и прочитать в неделю три книги».

Большое влияние на Франсуа оказал писатель и кинокритик Андре Базен, прививший ему любовь к кино.

Вместе с другим будущим режиссёром, Жан-Люком Годаром, Трюффо пишет статьи для журнала Базена «Cahiers du Cinema». Впоследствии Трюффо будет работать с Годаром над сценариями фильмов «На последнем дыхании» и «История воды».

В 1957 году Трюффо женился на Мадлен Моргенштерн, которая родила ему двух девочек (в 1959 и 1961). Тесть Франсуа, продюсер и кинопрокатчик, помог молодому человеку начать карьеру в кино. В 1965 году Трюффо развёлся с Мадлен.

Заметное место в творчестве Трюффо занимает своеобразный цикл фильмов, объединенных одним героем, Антуаном Дуанелем. Цикл начинается полуавтобиографическим фильмом «Четыреста ударов» (Les Quatre cents coups, 1959, Гран-при на Каннском фестивале) и продолжается в таких фильмах, как «Антуан и Колетт» (Antoine et Colette, новелла в фильме «Любовь в 20 лет», 1962), «Украденные поцелуи» (Baisers volés, 1968, c Жан-Пьером Лео, Клод Жад), «Семейный очаг» (Domicile conjugale, 1970, Жан-Пьер Лео, Клод Жад), «Сбежавшая любовь» (L’amour en fuite, 1979, c Жан-Пьером Лео, Клод Жад). Известно, что Трюффо, которому Клод Жад обязана прозвищем «маленькой невесты французского кино», хотел сочетаться с ней браком и просил у её родителей руки их дочери. Однако в последний момент он передумал. Клод Жад сумела простить, и они остались друзьями на всю жизнь.

Фильм Трюффо «Американская ночь» (1973) получил премию «Оскар» в номинации «за лучший иностранный фильм».

Самая известная роль Трюффо — в фильме Стивена Спилберга «Близкие контакты третьей степени» (1977).

В 1981 году он снял в своём фильме «Соседка» актрису Фанни Ардан и с этого времени она стала его подругой и родила ему дочь.

Трюффо умер от рака мозга 21 октября 1984 в парижском пригороде Нейи-сюр-Сен.