Всеволод Илларионович Пудовкин родился по старому стилю — 16 февраля, по новому стилю — 28 февраля 1893 года в Пензе (через четыре года семья переехала в Москву). Его отец происходил из крестьян. Работая приказчиком, коммивояжером, он имел возможность дать сыну образование.
Пудовкин учился в шестой московской гимназии, увлекался живописью, игрой на скрипке, сочинительством пьес, астрономией, физикой, математикой, химией.
Родители видели его медиком, Всеволод же поступил на отделение естественных наук физико-математического факультета Московского университета.

Пудовкин не успел сдать выпускных экзаменов — началась война и он добровольцем ушёл на фронт. Служил в артиллерии. Во время боев на Мазурских болотах Пудовкин был ранен в руку и в январе 1915 года попал в плен. В лагере под городом Килем (Померания) Пудовкин работал химиком. 

В конце 1918 года он совершил удачный побег из плена. Вернувшись в Москву, устроился делопроизводителем в военкомат, через некоторое время — химиком московского завода «Фосген-1» .

В 1920 году в жизни Пудовкина произошёл крутой поворот — он поступил в Первую государственную школу кинематографии при Всероссийском фотокиноотделе Наркомпроса. Пудовкин занимался в классе Владимира Гардина, известного режиссёра, актёра, сценариста, затем перешёл в мастерскую Льва Кулешова.

Будучи студентом, Пудовкин начал принимать участие в создании фильмов. Как актёр он снимался с 1920 года, в том числе в картине Гардина «Серп и молот» (1921), на которой был и сорежиссёром. Вместе с Гардиным поставил пропагандистский фильм «Голод. Голод. Голод» (1921), написал сценарий ленты «Слесарь и канцлер» (1923, по пьесе А.В. Луначарского). 

В 1924 году Пудовкин женился на актрисе Анне Николаевне Земцовой (снималась в кино под именем Анна Ли).
После ухода из коллектива Кулешова Пудовкин рисовал карикатуры для журнала "Безбожник". Зимой он работал над книгами о кинорежиссуре и сценарном искусстве, а весной 1925 года поступил на студию "Межрабпом-Русь".
Учитывая большой интерес Пудовкина к естественным наукам, руководство студии поручило ему постановку научно-популярного фильма "Поведение человека" ("Механика головного мозга") (1926), излагающего сущность опытов и учения физиолога И.П. Павлова.
Фильм получил высокую оценку Рокфеллеровского института в США, использовался в качестве учебного пособия в университетах Англии.

Предложение одного из руководителей "Межрабпома" М. Алейникова поставить фильм по роману "Мать" А.М. Горького было для Пудовкина неожиданным. Вершиной творчества Пудовкина стали его фильмы второй половины 1920-х годов: «Мать» (1926, по А.М. Горькому), «Конец Санкт-Петербурга» (1927) и «Потомок Чингис-хана» (1928, в международном прокате — «Буря над Азией»), которые образовали трилогию о революционных переменах в начале 20 века. Отличие Пудовкина от других мастеров монтажно-поэтического кинематографа 1920-х годов заключается в индивидуализированном (а не только типажном) показе героев на экране, внимательной работе с актёрами, дотошной проработке деталей в кадре. Вместе с оператором А.Д. Головнёй Пудовкин добивался изобразительно выверенного кинематографического эффекта. Актёрская работа Пудовкина в экранизации «Живого трупа», осуществлённой в 1929 году Ф.А. Оцепом, демонстрирует высокий уровень проникновения в психологию Фёдора Протасова, по собственной воле выключившего себя из жизни.

Попытка Пудовкина применить методы монтажного кинематографа для исследования психологического состояния человека в фильме «Простой случай» (1932, сценарий А.Г. Ржешевского) привела к неоднозначному художественному результату. Картина стала странным симбиозом экспериментаторских наворотов и заурядной истории измены в семье красного командира. Режиссёр подвергся резкой критике, в том числе за упорное следование устаревшей стилистике немого кино, поэтому срочно был вынужден сделать идеологически и эстетически правильную картину «Дезертир» (1933) о революционной борьбе рабочего класса Германии.

Пудовкин с трудом приспосабливался к требованиям повествовательного кинематографа 1930-х годов и только в 1938 году создал пафосную «Победу» (1938, совместно с М.И. Доллером) о доблестных покорителях стратосферы. Большинство последующих лент Пудовкина относятся к биографическому жанру: «Минин и Пожарский» (1939, с Доллером), «Суворов» (1941, с Доллером) — за оба фильма Сталинская премия 1941 года, «Адмирал Нахимов» (1947, Сталинская премия), «Жуковский» (1950, с Д.И. Васильевым, приз Карловарского кинофестиваля; Сталинская премия за 1951 год). Особенно был удачен «Суворов» (в главной роли Н.П. Черкасов).

Антифашистская картина «Убийцы выходят на дорогу» (1942, с Ю.В. Таричем) во избежание аллюзий со сталинской диктатурой даже не была представлена на просмотр для высшего руководства и запрещена нижестоящими инстанциями. Пафосные военные драмы — новелла «Пир в Жирмунке» (с Доллером) в «Боевом киносборнике № 6» (1941) и «Во имя Родины» (1943, с Васильевым, по пьесе «Русские люди» К.М. Симонова, Пудовкин сыграл также роль немецкого офицера), как и послевоенные социальные киноповести («Три встречи», 1948, выпуск — 1950, с С.И. Юткевичем и А.Л. Птушко) и «Возвращение Василия Бортникова» (1953, по роману «Жатва» Г.Е. Николаевой), не лишены тенденциозности искусства сталинской эпохи, хотя и отличаются характерным для Пудовкина интересом к людским судьбам. 

В 1944 году Пудовкина избрали президентом киносекции ВОКС, которая осуществляла практически все международные связи советской кинематографии по общественной и творческой линии.
В последние годы своей жизни Пудовкин много путешествовал. Он мог свободно изъясняться на трёх языках, перед поездкой читал не только справочники и путеводители, но и серьёзные книги по искусству.

На протяжении почти всей своей творческой жизни Пудовкин не прекращал актёрской деятельности. Его последней значительной ролью стал Юродивый в «Иване Грозном» (1945) С.М. Эйзенштейна. Пудовкин был крупнейшим кинотеоретиком своего времени. Его книги «Кинорежиссёр и киноматериал» (1926), «Киносценарии. Теория сценария» (1926), «Актёр в фильме» (1934), теоретические статьи переводились на многие языки мира.

В июне 1953 года В.И. Пудовкин отдыхал в Доме творчества Дубулты под Ригой, когда его свалил грипп с высокой температурой. Чуть поправившись, он с присущим ему азартом бросился играть в теннис. В ту же ночь Пудовкин получил микроинфаркт. Через день-другой ему стало лучше, но, когда он решил встать, его поразил обширный инфаркт сердца, потом инфаркт лёгкого...
Летом 1953 года Всеволод Илларионович Пудовкин скончался.
Похоронен в Москве на Новодевичьем кладбище (2 участок, 39 ряд, 20 могила).