Владимир Маковский родился 26 января (7 февраля) 1846 в Москве, в семье видного деятеля искусств Е. И. Маковского, одного из основателей Московского училища живописи, ваяния и зодчества. Мать Владимира — Любовь Корнилиевна (урождённая Моленгауэр). Брат художника Маковского Константина Егоровича.

Квартира Маковских находилась на набережной Москва-реки с видом на Кремль. С детства Владимира окружала атмосфера искусства. В доме отца собирались известные люди — Глинка, Гоголь, Щепкин, Брюллов, Тропинин… Устраивались литературные, рисовальные и музыкальные вечера. В семье было пятеро детей — старшая дочь Александра, сыновья Константин, Николай, Владимир и младшая дочь Мария. Они стали известными художниками, а Мария — певицей. От матери Владимир унаследовал красивый голос, учился играть на гитаре и скрипке, довольно рано начал рисовать. Первые уроки изобразительного искусства Маковский брал у В. А. Тропинина. В пятнадцать лет он написал жанровую картину «Мальчик, продающий квас» (1861).

С 1861 по 1866 Владимир учился в Московском училище живописи, ваяния и зодчества у продолжателя Венециановской школы С. К. Зарянко, Е. С. Сорокина и самого В. А. Тропинина. Училище Владимир закончил с серебряной медалью и званием классного художника III степени за работу «Литературное чтение».

В 1869 за картину «Крестьянские мальчики стерегут лошадей» Маковский получил звание «классного художника первой степени с золотой медалью Виже-Лебрень за экспрессию». С рождением в 1869 году первого ребёнка, сына Александра, у Маковского проявляется интерес к детской тематике («Крестьянские мальчики», «Пастушки», «Ночное», «Возвращение с ночного»). Картина «Игра в бабки» стала первой картиной Маковского, купленной П. М. Третьяковым для своей галереи, что означало признание его как художника.

В 1873 за картину «Любители соловьев» Маковский был произведён Академией художеств в академики. Картина была выставлена на Всемирной выставке в Вене, где привлекла всеобщее внимание. Фёдор Достоевский писал о ней: «…если нам есть чем-нибудь погордиться, что-нибудь показать, то уж, конечно, из нашего жанра… в этих маленьких картинках, по-моему, есть даже любовь к человечеству, не только к русскому в особенности, но даже и вообще».

В это же время он написал 21 жанровую картину для альбома «Эпизоды Севастопольской жизни 1854—1855 годов».

В 1872 он стал членом Товарищества передвижных художественных выставок. С самого начала был одним из наиболее деятельных членов Товарищества, участвовал почти во всех выставках, а с 1874 года его избрали членом правления.

С 1882 по 1894 Маковский преподавал в МУЖВЗ. В 1892 году ему присвоили звание профессора. Вплоть до 1894 года он жил и работал в Москве в доме Дворцового ведомства у Каменного моста близ Храма Христа Спасителя, для росписи которого сделал несколько эскизов.

С 1894 по 1918 Маковский преподавал в петербургской Академии художеств, куда его пригласили на должность руководителя жанровой мастерской в Высшем художественном училище. В 1895 он был назначен ректором Академии. Учениками Маковского были А. Е. Архипов, В. Н. Бакшеев, Е. М. Чепцов, В.А.Кузнецов. С 1905 года - действительный статский советник.

Умер Владимир Маковский 21 февраля 1920 и был похоронен в Петрограде на Смоленском кладбище.